Das Hauptziel von RP2b ist es, die molekularen und zellulären Auswirkungen neuartiger Missense-Varianten mithilfe von In-vitro-Zellkulturmodellen zu untersuchen. Zum Beispiel sind NR1H4-Varianten ursächlich für PFIC, wobei das klinische Erscheinungsbild aufgrund des Fehlens der BSEP-Expression dem von PFIC2 ähnelt. Um die funktionellen Auswirkungen neuer NR1H4/FXR-Missense-Varianten zu untersuchen, wurde ein Luciferase-Assay in HEK293-Zellen entwickelt (Abbildung 1).

Ein weiteres Ziel ist die Etablierung eines fluoreszenzmarkierten BSEP-Trans-Inhibitionstests unter Verwendung von iPSC-abgeleiteten hepatobiliären Organoiden zur Diagnose der Antikörper-induzierten-BSEP-Defizienz (AIBD). Es handelt sich dabei um eine erworbene Form der intrahepatischen Cholestase, die nach einer Lebertransplantation bei PFIC2 auftreten kann. Dieser Test wird die BSEP-Trans-Inhibition durch BSEP-spezifische Antikörper direkt messen (Abbildung 2).

Das RP2b-Teilprojekt kann das Verständnis cholestasebedingter Varianten auf molekularer und zellulärer Ebene vertiefen, die Vorhersage der Progression der Antikörper-induzierten-BSEP-Defizienz (AIBD) verbessern und den Weg für die Entwicklung gezielter Therapien ebnen.

Das Teilprojekt wird an der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg (Projektleitung: Prof. Dr. Verena Keitel-Anselmino, wissenschaftlicher Mitarbeiter: Dr. Alex Bastianelli und technische Angestellte Aileen Nötzold) bearbeitet.

Abbildung 1. Entwicklung eines Luciferase-Assays zur Untersuchung der funktionellen Folgen genetischer Varianten von NR1H4.

(A) Das Natrium-Taurocholat-Kotransportprotein (NTCP) und die Gallensalzexportpumpe (BSEP) sind essentielle Transporter, die für die Aufnahme und Exkretion von hepatischen Gallensalzen verantwortlich sind. Der Farnesoidhormon-X-Rezeptor (FXR), kodiert durch das NR1H4-Gen, fungiert als primärer transkriptioneller Regulator der BSEP-Expression, die entscheidend für den Gallensalz-Efflux ist. Diese Regulation hängt von der Wechselwirkung zwischen FXR und dem Retinoid-X-Rezeptor α (RXRα) ab, wobei ein Heterodimer gebildet wird, das spezifisch an die hochkonservierte invertierte Wiederholungssequenz 1 (IR-1) im proximalen BSEP-Promoter bindet. (B) Ein pGL3-basiertes Luciferase-Reporterplasmid wird vom BSEP-Promoter gesteuert (pGL3-BSEPprom). Nach der Transfektion von HEK293-Zellen mit pGL3-BSEPprom und Expressionsplasmiden für RXRα und FXRα wird die Aktivierung von FXR/RXRα durch Liganden durch die Luciferase-Aktivität gemessen, was eine funktionale Auswertung der transkriptionalen Aktivität von FXR ermöglicht und die Untersuchung der biologischen Auswirkungen von FXR-Varianten erleichtert.

Abbildung 2. Entwicklung eines Organoid-basierten Fluoreszenzfarbstoff-BSEP-Trans-Inhibitionsassays zur Diagnose von AIBD.

(A) Die Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren (GS) ist eine essentielle Funktion der Leber. Eine schwere BSEP-Defizienz (PFIC2) wird durch reduzierte oder fehlende BSEP-Expression verursacht und führt zu einer Störung des enterohepatischen GS-Kreislaufs sowie zur Ansammlung von BS in Hepatozyten und im Blutkreislauf. (B) Die funktionelle BSEP-Expression im Transplantat stellt den enterohepatischen BS-Kreislauf wieder her. Einige Patienten zeigen jedoch eine Wiederkehr der Symptome, die durch die Entwicklung von BSEP-inhibitorischen Antikörpern verursacht wird, die als „antikörperinduzierte BSEP-Defizienz“ (AIBD) bezeichnet werden. Nachdem sie den kanalikulären Raum entweder über einen parazellulären Weg oder durch Transzytose betreten haben, können sie binden und BSEP trans-inhibieren. (C) iPSC-abgeleitete hepatobiliäre Organoide (HBOs) werden mit Serum-IgG von gesunden Kontrollen und fluoreszenzmarkierten Gallensalzen (z.B. Tauro-nor-THCA-24 DBD) inkubiert, die über NTCP von den Zellen aufgenommen und über BSEP in das Organoid-Lumen transportiert werden. In Gegenwart von Kontroll- oder Nicht-AIBD-Seren bleibt der BSEP-vermittelte Transport von fluoreszierenden Substraten in das Lumen unbeeinflusst. (D) Im Gegensatz dazu führt die Inkubation von HBOs mit AIBD-Seren, die BSEP-reaktive und inhibitory IgG enthalten, zu einer BSEP-Trans-Inhibition, die den Transport von fluoreszierenden Substraten in das Lumen beeinträchtigt. Die Fluoreszenzintensität im Lumen dient als funktionale Auswertung der BSEP-Aktivität und ermöglicht die Detektion von anti-BSEP-Antikörpern im menschlichen Serum.

-Abbildungen erstellt unter Nutzung von BioRender-